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真菌近完成圖測序

真菌近完成圖測序 




 

 真菌近完成圖測序

真菌近完成圖測序是指對基因組序列未知或無近緣物種基因組信息的某個物種,構建不同插入片段的基因組DNA文庫,采用第三代單分子測序技術結合第二代高通量測序技術對文庫進行序列測定,然后利用生物信息學方法進行組裝和注釋,從而獲得該真菌的全基因組和甲基化組。

應用領域

l 獲得接近完整的真菌全基因組序列圖譜

l 獲得甲基化修飾相關信息(6mA和4mC)

l 解析真菌基因組中存在的大片段重復序列

測序優勢

(1) 方案設計合理:完成圖的方案以三代平臺為主、二代平臺為輔,平臺完美結合,得到接近完整的染色體及線粒體序列;

(2) 完備的樣品提取及純化方案,兼顧 DNA 質量及項目周期;

(3) 免費贈送待測菌株的菌種鑒定,以防菌株錯測;

(4) 拼接結果準確:三輪校正(拼接前利用三代測序數據間的 Overlap 對測序數據進行校正;拼接后,利用三代測序數據對拼接結果進行第二輪校正;最后,利用高質量的二代測序數據對拼接結果進行多次校正)使得到的基因組拼接結果更加準確、可靠;

(5) 專業的分析團隊,豐富的項目經驗,提供個性化的信息分析內容。

送樣要求

送樣形式

送樣要求

菌體

菌體濕重 ≥ 3 g(酵母菌和霉菌)

菌絲球,培養體系 ≥ 1 L,直徑1~3 mm(大型真菌)

DNA

總量 ≥ 60 µg(熒光定量)

OD260/OD280 = 1.8~2.0

OD260/OD230 = 2.0~2.2


信息分析內容

序號

分析項目

類型

分析

備注

1

下機數據統計

A

   

2

數據質控

A

   

3

高質量數據獲取

A

   

4

Survey 分析

A

   

5

基因組拼裝

A

   

6

基因組拼裝效果評價

A

   

7

基因組拼裝完整性與連續性評估

A

   

8

重復序列分析

A

   

9

非編碼 RNA 預測

A

   

10

蛋白編碼基因預測

A

   

11

碳水化合物活性酶(CAZy)分析

A

   

12

細胞色素 P450 家族分析

A

   

13

蛋白編碼基因的序列比對

A

   

14

蛋白編碼基因的 GO 注釋

A

   

15

蛋白編碼基因的 eggNOG 注釋

A

   

16

蛋白編碼基因的 KEGG 注釋

A

   

17

蛋白編碼基因的 Swiss-Prot 注釋

A

   

18

蛋白編碼基因的結構域分析

A

   

19

序列比對分析

A

   

20

SNP 分析

A

   

21

InDel 分析

A

   

22

基因家族分析

B

 

基因組數量 ≥ 2

23

Venn 繪制

B

 

基因組數量 ≥ 2

24

單拷貝基因的蛋白序列一致性分析

B

 

基因組數量 ≥ 3

25

基因家族擴張和收縮分析

B

 

基因組數量 ≥ 3

26

dNdS 分析

B

 

基因組數量 ≥ 2

27

基于全基因組單拷貝基因的進化樹重構

B

 

基因組數量 ≥ 3

28

分歧時間估算

B

 

基因組數量 ≥ 3

29

基因組數據上傳

B

   

30

基因組圈圖繪制

A

   

A:標準信息分析;

B:高級信息分析。


信息分析流程

高級信息分析內容示例

基于單拷貝的全基因組進化分析

ω值分布圖

經典案例:

利用第三代單分子測序技術結合光學圖譜技術獲得真菌接近完整的全基因組序列圖譜

mBio 2015 IF:6.975

關鍵詞:光學圖譜技術;端粒;DNA 轉座元件;第三代單分子測序技術

研究背景

真核生物中存在大量的重復序列,這些重復序列會對基因組組裝造成很大的影響。傳統的高通量測序技術受制于讀長,無法完全解析這些重復序列。第三代單分子測序技術平均讀長可達到 10~15 kb,最長讀長超過 60 kb,能很好地解析富含重復的區域。光學圖譜技術可用于構建高分辨率的圖譜。本研究采用第三代單分子測序技術結合光學圖譜技術獲得了一個 36 Mb 真菌接近完整的全基因組序列圖譜。

實驗方法

供試樣本:棉花黃萎病菌 Verticillium dahliae;

文庫大?。?2,000 bp,采用 BluePippin 去除 7,000 bp 以下的片段;

測序數據: 14 SMRT Cell P4-C2 + 4 SMRT Cell P5-C3

測序平臺:PacBio RS II;

研究結果

(1) 采用單獨的 Pacbio 測序數據進行拼接效果最好;

(2) 兩步法拼接(第一步采用 A5MiSeq對 MiSeq 數據進行拼接;然后采用PBjelly利用 Pacbio 數據進行拼接)相比一步法(直接采用 SPAdes對MiSeq數據和Pacbio 數據進行拼接)拼接效果更好;

(3)Pacbio 測序數據對拼接效果改善非常顯著(見表 1);

(4) 相比 MHAP 軟件,HGAP 拼接效果更好(三代測序數據);

(5)當三代測序數據量超過 50 ×,數據量的增加對拼接結果的改善非常顯著;當測序數據量超過100 ×,數據量對拼接結果的改善效果不顯著 (見表 2)。

參考文獻

Luigi Faino , Michael F. Seidl , et al. Single-Molecule Real-Time Sequencing Combined with Optical Mapping Yields Completely Finished Fungal Genome. Mbio, 2014, 6 (4).

項目經驗

拉丁名

基因組大小

GC含量

派森諾已完成數目

Saccharomyces pastorianus

22.3

39.25

1

Cerrena.sp

43.66

47.48

1

Chaetomium thermophilum

28.32

52.6

1

Aspergillus terreus

29.36

52.2

1

colletotrichum orbiculare

90.08

37.8

1

cladosporium sphaerospermum

38.52

54.3

1

lentinula edodes

41.36

46

1

Fusarium proliferatum

44.18

48.4

2

表一

表二

 
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